1 發病狀況
自2011年12月中(zhōng)下(xià)旬起，華東地區兩家規模化豬場（豬場A與豬場B）先後發生(shēng)大(dà)規模的腹瀉。發病急，傳播快，7天内各生(shēng)産階段的豬均出現腹瀉。不同年齡階段豬隻的發病順序也基本一(yī)緻，均是育肥豬先出現水樣腹瀉，而後傳染至保育豬，再到妊娠母豬，最後是産房母豬與哺乳仔豬。兩豬場均曾使用流行性腹瀉－傳染性胃腸炎二聯滅活疫苗在妊娠後期進行後海穴注射免疫，免疫2次。
2 臨床症狀
育肥豬、保育豬與母豬呈水樣腹瀉，糞便呈水泥漿樣或黃色。哺乳仔豬通常在出生(shēng)後12小(xiǎo)時内出現嘔吐（圖1），随後開(kāi)始腹瀉，糞便常呈黃色、棕色、白(bái)色等，顔色不一(yī)（圖2），脫水後畏寒，迅速發生(shēng)死亡（圖3），7日齡内的豬隻發病率幾乎100％，死亡率高達70～80％（圖4）。腹瀉的保育豬消瘦，體(tǐ)表常被稀糞污染，紮堆（圖5）。哺乳母豬腹瀉時或腹瀉康複期後，常出現乳房萎縮，奶水不足（圖6）。
3 病因診斷
3.1 剖檢病變
豬場A與豬場B發病仔豬的共同病變如下(xià)：脫水嚴重，皮膚無彈性。胃内充滿未消化的乳糜。小(xiǎo)腸空虛，腸壁變薄，常充滿氣體(tǐ)。腎髒表面散布着大(dà)量的針尖狀出血點，其它髒器無顯著一(yī)緻性病變。但豬場A多頭仔豬的腎盂内有大(dà)量的結晶物(wù)，可能與在哺乳母豬飼料中(zhōng)添加大(dà)量的磺胺類藥物(wù)有關。
3.2 實驗室診斷
3.2.1 病料采集。豬場A：采集以下(xià)病料 a.發病仔豬的小(xiǎo)腸及其内容物(wù)；b：康複10～12天的後備母豬、1胎次母豬及經産母豬的糞便；c：正在發病的20日齡仔豬的糞便；豬場B：采集發病仔豬的小(xiǎo)腸及内容物(wù)。疫苗樣品：某品牌的流行性腹瀉與傳染性胃腸炎二聯活疫苗。
3.2.2 病料預處理。仔豬小(xiǎo)腸：剪取2cm腸管，剪碎，用PBS 以1:10的重量體(tǐ)積比進行稀釋後勻漿，混合物(wù)于4℃ 2000g離(lí)心15min，收集上清液，立即提取RNA。糞便樣品：用PBS 以1:10的重量體(tǐ)積比進行稀釋後，渦旋混勻，該混合物(wù)于4℃ 2000g離(lí)心15min，收集上清液，立即提取RNA。
3.2.3 RNA提取與反轉錄：按照Geneaid公司病毒核酸提取試劑盒說明書(shū)提取RNA。根據寶生(shēng)物(wù)工(gōng)程(大(dà)連)有限公司RT-PCR試劑盒（TaKaRa Code：DRR036A）說明，采用10μL的反轉錄反應體(tǐ)系：5×RT Master Mix 2μL、Total RNA 4μL、RNase Free dH2O 4μL，混勻後，于PCR儀上進行反轉錄：37℃ 15min，85℃ 5 min。
3.2.4 PCR檢測：1）PEDV的檢測：根據GeneBank收錄的PEDV M基因c DNA序列(登陸号JF690778.1)，設計合成引物(wù)，用于擴增PEDV的M基因片段(317bp)。引物(wù)序列如下(xià)：M1：5’-CATTCGGTTGTGGCGCAGGAC-3’(M基因297~317)；M2：5’-CGCCGTGTTTGGACCGGACATA-3’(M基因592~613)。采用20μL的PCR反應體(tǐ)系，混勻後進行擴增，擴增條件爲:95℃預變性5min；95℃變性30s，59℃複性30s，72℃延伸30s，30個循環；72℃終延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。2) TEGV的檢測：與PEDV的檢測過程類似。所擴增目的片段長度爲：792bp。
3.2.5 RT-PCR檢測結果 從圖11可知(zhī)，豬場A與豬場B腹瀉仔豬的腸管樣品均是流行性腹瀉病毒呈陽性，傳染性胃腸炎病毒呈陰性。而P-D二聯活疫苗呈傳染性胃腸炎與流行性腹瀉雙陽性。圖12可知(zhī)，腹瀉仔豬的糞便樣品呈流行性腹瀉病毒陽性，而腹瀉結束後10～12天的生(shēng)長育肥豬、後備母豬、一(yī)胎母豬及經産母豬的糞便樣品均呈流行性腹瀉病毒陰性。說明處于康複期（腹瀉結束後10左右）的豬隻不再通過消化道途徑向環境中(zhōng)排毒。
根據臨床症狀、剖檢病變及實驗室檢測可判斷：這兩例哺乳仔豬腹瀉均是由流行性腹瀉病毒感染所導緻。
4 控制措施
目前針對流行性腹瀉尚無特異性治療方法，疫苗緊急免疫效果也不佳，建議多采取支持性治療。
4.1 哺乳仔豬
a.保溫：做好産房，特别是保溫箱等局部的保溫工(gōng)作，7日齡内的仔豬，産房局部溫度應控制在28℃～32℃之間；
b.補液：利用5％的葡萄糖生(shēng)理鹽水（提前預熱至35℃）進行腹腔補液，每次30毫升，每天2～3次；
c.防饑餓：當哺乳母豬奶水較差時，應及時進行交叉寄養或采用米湯水或人工(gōng)乳進行人工(gōng)飼喂，防止仔豬餓死；
d.生(shēng)物(wù)安全與清潔衛生(shēng)：減少人員(yuán)流動，加強衛生(shēng)消毒措施，并注意控制産房内的濕度（40％～80％之間）。
4.2 保育仔豬、生(shēng)長育肥豬
a.适當限飼：在腹瀉期間，将發病豬群的飼料添加量降低爲正常水平的三分(fēn)之一(yī)，盡量使用濕拌料。
b.加強補液，防止仔豬脫水，添加電解多維，防止酸中(zhōng)毒，适當的添加一(yī)些抗生(shēng)素，如金黴素、阿莫西林等，防止大(dà)腸杆菌或沙門氏菌等繼發感染。同時，做好保溫與衛生(shēng)消毒工(gōng)作。
4.3 後備母豬、妊娠母豬及哺乳母豬
a.返飼：利用發病24小(xiǎo)時内的哺乳仔豬小(xiǎo)腸管及其内容物(wù)、糞便等破碎，勻漿後，加上一(yī)定劑量抗生(shēng)素（如青鏈黴素、慶大(dà)黴素、新黴素等）後，分(fēn)兩批次進行返飼，并及時進行返飼效果跟蹤判斷；（具體(tǐ)方法見下(xià)文叙述）。
b.催乳：母豬腹瀉後，常出現奶水不足的狀況，造成仔豬大(dà)量死亡。可通過調整哺乳料的營養水平或添加催乳劑等飼料添加劑來增加母豬奶水。
5 讨論與小(xiǎo)結
5.1 豬流行性腹瀉
豬流行性腹瀉是由冠狀病毒（豬流行性腹瀉病毒）感染所導緻一(yī)種以水樣腹瀉、豬隻逐漸消瘦爲主要特征的病毒性疾病。可感染各生(shēng)長階段的豬隻，在歐洲該病對斷奶仔豬與生(shēng)長育肥豬的影響較大(dà)，對哺乳仔豬的影響比較溫和（即使沒有PED母源抗體(tǐ)存在），但在亞洲該病對哺乳仔豬的影響非常大(dà)，死亡率可高達80％以上。好發于冬春寒冷季節，但2011年山東以南(nán)各省份全年均有急性病例，東北(běi)三省的發病率相對較低。主要臨床症狀爲豬隻食欲減退、嘔吐、腹瀉、脫水、甚至死亡。剖檢主要病變爲腸壁（特别是小(xiǎo)腸壁）變薄甚至呈半透明狀，胃内常充滿未消化的凝乳塊。其臨床症狀、剖檢變化與傳染性胃腸炎非常相似。與之前的報道所不同的是：在這兩個病例中(zhōng)均發現腎髒表面散布着大(dà)量的針尖狀小(xiǎo)出血點。但通過RT-PCR檢測确定豬場A與豬場B的仔豬腸管樣品中(zhōng)均呈流行性腹瀉病毒陽性。此檢測結果與Sun RQ等人在2010～2011年對我(wǒ)國9家規模化豬場病毒性腹瀉的檢測結果一(yī)緻，導緻10日齡内哺乳仔豬的發病率與死亡率高達80％。據國際獸醫局（OIE）調查，豬流行性腹瀉與豬繁殖與呼吸系統綜合征是近年來影響亞太地區養豬工(gōng)業最重要的兩種疾病。
流行性腹瀉病毒（PEDV）主要通過糞便進行傳播，也可通過患病哺乳母豬的奶水進行傳播[1]，通過糞－口途徑進行感染。經檢測，這兩個發病豬場的患病仔豬糞便均呈PEDV陽性，但豬場A康複10～12日後妊娠母豬與哺乳母豬糞便樣品均呈PEDV陰性，說明康複10日後，豬隻不再向外(wài)界環境排毒。DaeSub Song等人[4]使用Vero細胞緻弱的PEDV通過口服方式人工(gōng)感染2周齡的哺乳仔豬與妊娠後期母豬，發現仔豬通過糞便最長病毒排毒時間爲感染後的第9天，而母豬最長的向外(wài)排毒時間爲感染後的第3天。兩者的結論一(yī)緻，但野毒對外(wài)排毒的持續期可能比緻弱毒株要長些[5]。在本案例中(zhōng)，這些康複母豬所分(fēn)娩的新生(shēng)仔豬依舊(jiù)發病了，可能原因如下(xià)：第一(yī)，因棟舍設計限制，本豬場在發病期間也無法做到全進全出，加之消毒措施不徹底，環境中(zhōng)存在的PED病毒會感染新生(shēng)仔豬；第二，雖然康複母豬或經過返飼（豬場A）的母豬已産生(shēng)了母源抗體(tǐ)，但哺乳母豬的奶水普遍不佳（圖6），無法通過奶水中(zhōng)的母源抗體(tǐ)來保護新生(shēng)仔豬。
5.2 豬流行性腹瀉疫苗與免疫失敗原因分(fēn)析
開(kāi)發高效的豬流行性腹瀉疫苗是當前科學界面臨的一(yī)個巨大(dà)挑戰。在本次疫情中(zhōng)，雖然兩豬場在妊娠母豬分(fēn)娩前利用流行性腹瀉－傳染性胃腸炎二聯滅活疫苗（疫苗毒株：CV777）進行跟胎免疫，但豬群發病快，仔豬死亡率高，說明當前所用疫苗的保護率不佳。主要的原因可能如下(xià)：1）疫苗毒株：流行性腹瀉病毒變異較快，各國的疫苗毒株也有所不同，如日本：P-5V，韓國：KPEDV-9[6]。冠狀病毒的纖突蛋白(bái)（S）基因變異性高且能夠誘導産生(shēng)中(zhōng)和抗體(tǐ)[ 7]。據Sun RQ等人[1]報道,2010～2011年所檢測的仔豬流行性腹瀉病毒S基因部分(fēn)片段與疫苗株CV777之間的同源性爲93.3%～94.7％，基因系統進化分(fēn)析表明：新病毒株與以往的毒株及疫苗株均有所不同。2）疫苗類型：目前已商(shāng)品化的疫苗包括滅活疫苗與活疫苗兩類，我(wǒ)國以滅活疫苗爲主，而韓國與日本以商(shāng)品化的流行性腹瀉活疫苗爲主[8]。3）免疫途徑：目前我(wǒ)國所使用的滅活疫苗采用後海穴注射免疫。但實驗證明：利用Vero細胞緻弱的流行性腹瀉活疫苗通過不同免疫途徑對懷孕後期母豬進行免疫,口服免疫組的死亡率(13%)明顯低于肌肉注射組（60％），口服免疫組仔豬體(tǐ)内的IgA抗體(tǐ)的濃度更高[9]。4）抗原含量：流行性腹瀉病毒對培養條件要求苛刻，要達到有效的抗原滴度也存在一(yī)定的挑戰。
5.3 流行性腹瀉的複發與返飼技術應用
在本次疫病流行過程中(zhōng)，多家規模化豬場報告其豬場在一(yī)個月時間内連續兩次爆發流行性腹瀉。這可能因爲在首次感染時，母豬群未被全部感染，存在一(yī)定比例的易感（空白(bái)）豬隻，使得流行性腹瀉病毒得以再次感染易感豬群。美國、加拿大(dà)等國家在藍(lán)耳病爆發時，很多豬場管理人員(yuán)爲了縮短藍(lán)耳病對豬群的感染期會使用已發病豬隻的血清對全群豬進行同期感染。而在流行性腹瀉與傳染性胃腸炎的控制上，因商(shāng)品化疫苗效果欠佳，返飼技術被廣泛使用且取得了較好的效果，兩者的免疫機理基本類似。所謂的返飼技術就是采用新發病哺乳仔豬的腸管、糞便等（發病24小(xiǎo)時内采集病料最佳）病毒攜帶物(wù)通過口服方式感染母豬群，使其通過自然感染的途徑産生(shēng)免疫，新生(shēng)仔豬通過母乳獲得特異性母源抗體(tǐ)而獲得保護。
爲降低返飼過程中(zhōng)病毒擴散風險，确保返飼措施的效果，應注意以下(xià)幾點:1) 返飼病料選擇：主要爲新發腹瀉的哺乳仔豬的腸管、内容物(wù)及稀便，發病24小(xiǎo)時内采集病料爲佳；2）生(shēng)物(wù)安全控制：返飼期間的豬隻應由專人管理，降低操作人員(yuán)的走動及與其它工(gōng)作人員(yuán)的接觸。3）返飼的批次與範圍：主要針對妊娠母豬、哺乳母豬及後備母豬群，應分(fēn)兩批次進行。第一(yī)批主要針對懷孕100天以内的妊娠母豬及後備母豬，使其在分(fēn)娩前産生(shēng)免疫力；第二批主要針對懷孕100天以後的妊娠母豬及哺乳母豬，需等到其斷奶後再進行統一(yī)返飼。4）返飼效果的判定：5）返飼豬隻護理：爲防止酸中(zhōng)毒與細菌性繼發感染，在返飼期間應在飲水或飼料中(zhōng)添加電解多維與抗生(shēng)素。
5.4 展望
雖然目前已通過基因序列分(fēn)析發現導緻2010～2012年的流行性腹瀉疫情的毒株與以往毒株有所不同，但因分(fēn)離(lí)培養技術與條件的限制，目前僅有少數的實驗室能夠分(fēn)離(lí)培養該毒株。新毒株的成功分(fēn)離(lí)培養與人工(gōng)緻弱将大(dà)力推動我(wǒ)國流行性腹瀉活疫苗的研發進程。其次，可進一(yī)步研究新毒株基因變異狀況，以确定基因變異對病毒毒力、免疫原性及交叉保護性的影響。此外(wài)，雖然在2011年，該病波及我(wǒ)國的各養豬大(dà)省，但南(nán)方的發病率與仔豬死亡率明顯高于東北(běi)三省。科學有效的流行病學調查，有利于揭示該病流行的流行特點與緻病條件。
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