β-Mercaptoethanol 蛋白質(zhì)電(diàn)泳 是一種有(yǒu)機化合物(wù)，其化學(xué)式為(wèi)HOCH2CH2SH，英文(wén)通用(yòng)縮寫為(wèi)ME或βME。
它兼具(jù)乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能(néng)團，為(wèi)揮發性液體(tǐ)，具(jù)有(yǒu)較強烈的刺激性氣味。
βME通常用(yòng)于二硫鍵的還原，可(kě)以作(zuò)為(wèi)生物(wù)學(xué)實驗中(zhōng)的抗氧化劑。它被廣泛使用(yòng)的原因是其具(jù)有(yǒu)的羟基使它能(néng)夠溶解于水中(zhōng)，并且降低它的揮發性。
蛋白級(Protein Grade)産(chǎn)品及特點:
本産(chǎn)品用(yòng)于将蛋白質(zhì)的二硫鍵剪切成巯醇的溫和的還原劑。也稱為(wèi)β- 巯基乙醇或BME。
經常加入到酶溶液中(zhōng)來防止由于半胱氨酸巯基氧化/ 二硫鍵形成造成的催化位點失活；經常作(zuò)為(wèi)添加的保護劑使用(yòng)，終濃度為(wèi)5 及20mM，含不含EDTA 均可(kě)。
操作(zuò)步驟
（一）獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為(wèi)模闆，按基因序列設計一對引物(wù)（在上遊和下遊引物(wù)分(fēn)别引入不同的酶切位點），PCR循環獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用(yòng)TRIzol法從細胞或組織中(zhōng)提取總RNA，以mRNA為(wèi)模闆，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄産(chǎn)物(wù)為(wèi)模闆進行PCR循環獲得産(chǎn)物(wù)。
（二）構建重組表達載體(tǐ)
1、β- 巯基乙醇，蛋白級(Protein Grade)載體(tǐ)酶切：将表達質(zhì)粒用(yòng)限制性内切酶（同引物(wù)的酶切位點）進行雙酶切，酶切産(chǎn)物(wù)行瓊脂糖電(diàn)泳後，用(yòng)膠回收Kit或凍融法回收載體(tǐ)大片段。
2、PCR産(chǎn)物(wù)雙酶切後回收，在T4DNA連接酶作(zuò)用(yòng)下連接入載體(tǐ)。
（三） 獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種
1、 将連接産(chǎn)物(wù)轉化大腸杆菌DH5α，根據重組載體(tǐ)的标志(zhì)（抗Amp或藍白斑）作(zuò)篩選，挑取單斑，堿裂解法小(xiǎo)量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正确,進入下步操作(zuò)。否則應篩選更多(duō)克隆，重複亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉化表達宿主菌的感受态細胞。
（四）誘導表達
1、 β- 巯基乙醇，蛋白級(Protein Grade)挑取含重組質(zhì)粒的菌體(tǐ)單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中(zhōng)37℃過夜培養。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中(zhōng), 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。
3、取部分(fēn)液體(tǐ)作(zuò)為(wèi)未誘導的對照組,餘下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作(zuò)為(wèi)實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
4、分(fēn)别取菌體(tǐ)1ml, 離心12000g×30s收獲沉澱，用(yòng)100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作(zuò)為(wèi)樣品,可(kě)做SDS-PAGE等分(fēn)析。
問題:蛋白質(zhì)緩沖液中(zhōng)，使用(yòng)β-Mercaptoethanol 或DTT的效果有(yǒu)什麽不同？
β-巯基乙醇和DTT都是還原劑，防止蛋白質(zhì)被氧化，β-巯基乙醇常用(yòng)濃度為(wèi)5-20MMOL/L，DTT為(wèi)0.5-1MMOL/L。因為(wèi)β-巯基乙醇加入緩沖液後24小(xiǎo)時易被氧化，
其後加速蛋白質(zhì)的失活，而DTT氧化後形成穩定的分(fēn)子内二硫健，并不危及蛋白的巯基，所以在蛋白制備中(zhōng)常用(yòng)β-巯基乙醇，而長(cháng)期儲存用(yòng)DTT。
還有(yǒu)其上提到的試劑濃度均指終濃度。
問題:蛋白loading buffer中(zhōng)的belta 巯基乙醇會揮發?
是的，一般來說，loading buffer都是室溫保存的，但其實β-Mercaptoethanol有(yǒu)很(hěn)大揮發性，應當現用(yòng)現配，就算是室溫保存，
也不應當超過30天，超過30天後應當再補充β-Mercaptoethanol
魯公(gōng)網安(ān)備 37021202000795号