dNTP混合物(wù)是dATP、dGTP、dCTP和dTTP的等摩爾混合物(wù)。以溶液鈉鹽形式提供，pH 7.0。可(kě)以作(zuò)為(wèi)耐熱DNA聚合酶的底物(wù)使用(yòng)。

進行PCR擴增時， dNTP混合物(wù)（2.5 mM）标準用(yòng)量是4 μl/50 μl反應體(tǐ)系。

本品2.5mM混合溶液中(zhōng)有(yǒu)四種核苷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），每一個的濃度都為(wèi)2.5mM。

DNTP 四種核苷酸,A、U、G、C.混合物(wù),主要作(zuò)用(yòng)在于PCR在第三步延伸的過程中(zhōng),需要這幾種核苷酸,以堿基互補原則,在酶的作(zuò)用(yòng)下與你需要擴增的模闆鏈進行連接,

從而達到複制模闆鏈的目的.

 

産(chǎn)品特點:

純度大于99 %

無DNase和RNase污染

無人類和E.coli DNA污染

避免頻繁的凍融，使用(yòng)之前混勻。

 

PCR 反應 概要:

1.配置反應體(tǐ)系

将各成分(fēn)依次加入到 0.5ml 的離心管中(zhōng)

擴增使用(yòng)熱啓動酶，可(kě)在常溫下操作(zuò)，非熱啓動型的酶要在低溫配置反應體(tǐ)系。

2.按照試劑盒說明書設置反應時間和溫度，擴增結束後電(diàn)泳鑒定

 

3.瓊脂糖核酸電(diàn)泳:

· 将電(diàn)泳所用(yòng)器具(jù)蒸餾水洗淨，架好梳子

· 根據要分(fēn)離的 DNA 片段大小(xiǎo)制備合适濃度的瓊脂糖凝膠，準确稱取一定的瓊脂糖加入到錐形瓶中(zhōng)，加入 30ml 左右的電(diàn)泳緩沖液（TAE 或 TBE）

· 在微波爐中(zhōng)加熱融化後冷卻至 40℃左右，充分(fēn)混勻後倒入電(diàn)泳槽中(zhōng)

· 室溫下凝固 40 分(fēn)鍾左右，小(xiǎo)心拔出梳子，将凝膠放置電(diàn)泳槽中(zhōng)準備點樣

· 在電(diàn)泳槽中(zhōng)加入電(diàn)泳緩沖液，漫過凝膠表面即可(kě)，點樣孔内不要有(yǒu)氣泡

· 樣品點樣前準備好，（在八連管中(zhōng)）加入 5ul 樣品，1ul 的 6xLoding buffer 和 1ul 的染料混合，用(yòng)搶将混合後的樣品緩緩注入到點樣孔中(zhōng)，注意不要串孔

· 按照正負極（紅正黑負），接通電(diàn)源，電(diàn)壓 40-60V，時間 30-40min，可(kě)根據溴酚藍的位置判斷是否終止電(diàn)泳

· 電(diàn)泳結束，關閉電(diàn)源，凝膠成像觀察，并對比 marker 确定片段大小(xiǎo)

   (不同的瓊脂糖濃度分(fēn)離不同大小(xiǎo)的 DNA 片段)

注意事項:

引物(wù)

引物(wù)是決定 PCR 反應成敗的關鍵，要保證擴增的準确、高效，引物(wù)的設計要遵循如下原則：

1. 引物(wù)的設計在 cDNA 的保守區(qū)域，在 NCBI 上搜索不同物(wù)種的同一基因，通過序列分(fēn)析的軟件，得到不同基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)

2. 引物(wù)的長(cháng)度：15-28bp，長(cháng)度大于 38bp，會使退火溫度升高，不利于普通 Taq 酶的擴增

3. 引物(wù) GC 含量在 40%-60%，Tm 值最好接近 72℃

4. 因密碼子的簡并性，引物(wù)的 3’端最好避開密碼子的第三位（最好為(wèi) T）

5. 堿基分(fēn)布錯落有(yǒu)緻，3’端不超過 3 個連續 G 或 C

6. 引物(wù)自身不要形成發夾結構，引物(wù)設計完成，要 BLAST 驗證

模闆

PCR 擴增對模闆的要求不高，單鏈、雙鏈 DNA 均可(kě)作(zuò)為(wèi)擴增片段，雖然 PCR 能(néng)夠擴增微量的 DNA，為(wèi)了保證擴增的特異性，對不同來源的模闆，起始濃度有(yǒu)一定要求，可(kě)以是純化後的樣品也可(kě)以是粗制品，不同來源的模闆采取不同的處理(lǐ)方法，實驗模闆的純化越簡單越好，但模闆中(zhōng)如果含有(yǒu)任何的 Taq 酶抑制劑、蛋白酶、核酸酶等，會幹擾反應。模闆提取注意保存，不能(néng)放置太久，避免反複凍融并防止降解。多(duō)數人會忽略這一問題，當實驗結果沒有(yǒu)任何條帶時，可(kě)優先考慮是否為(wèi)模闆降解的原因。

其他(tā)

1. Taq DNA 聚合酶：Taq 酶種類有(yǒu)很(hěn)多(duō)，熱啓動酶，高保真酶，根據各自實驗的應用(yòng)選擇合适的酶擴增，一般的反應，化學(xué)修飾的熱啓動酶即能(néng)很(hěn)好的完成，化學(xué)修飾熱啓動酶能(néng)夠     避免低溫下任何非特異性産(chǎn)物(wù)産(chǎn)生。酶的濃度對擴增有(yǒu)一定影響，酶用(yòng)量過多(duō)，會導緻非特異性産(chǎn)物(wù)，操作(zuò)按照說明書即可(kě)。

2. dNTP：四種 dNTP 的濃度要相同，其中(zhōng)任何一種濃度偏高或偏低，都會引發堿基的錯誤滲入。此外，dNTP能(néng)夠和體(tǐ)系中(zhōng)鎂離子結合，從而影響體(tǐ)系中(zhōng)鎂離子的濃度。

3. 緩沖液：緩沖液一般随酶提供，一般的 PCR 試劑盒包括 Taq 酶，緩沖液，dNTP，水。初次擴增，可(kě)以完全按照試劑盒的說明書操作(zuò)，如果擴增結果有(yǒu)問題，可(kě)自己嘗試摸索實驗     條件或重新(xīn)設計引物(wù)提取模闆擴增。

4. 因空氣中(zhōng)和手上有(yǒu)一定污染源，操作(zuò)過程中(zhōng)要戴手套，在幹淨的環境中(zhōng)配置反應體(tǐ)系，防止空氣中(zhōng)的污染源。

5. PCR 擴增的水要經過高壓滅菌或 0.2um 濾膜過濾。

6. 産(chǎn)物(wù)切膠回收二次擴增前，要先鑒定，二次擴增模闆稀釋 1000 倍。