熒光定量PCR（qPCR）是大家常用(yòng)的分(fēn)子生物(wù)學(xué)技(jì )術，根據實驗方法的不同

qPCR可(kě)以分(fēn)為(wèi)染料法（SYBR Green法為(wèi)代表）和探針法（Taqman法為(wèi)代表）

因為(wèi)操作(zuò)簡單，價格便宜，SYBR Green法qPCR 受到了更為(wèi)普遍的使用(yòng)。

但是SYBR Green法并非萬能(néng)的，在很(hěn)多(duō)時候SYBR Green無法滿足實驗的需要

Taqman qPCR特異性強，信噪比高，能(néng)夠适用(yòng)于多(duō)重qPCR，數據更具(jù)說服力

Taqman法qPCR的原理(lǐ):

Taqman是一段短的單鏈DNA探針，能(néng)夠和模闆DNA進行退火。Taqman探針的5’端帶有(yǒu)一個報告基團（R），3’端帶有(yǒu)一個猝滅基團（Q）。報告基團所發出的熒光會被猝滅基團所吸收，因此正常情況下熒光探針是不會發出熒光的。在PCR的延伸過程中(zhōng)，DNA聚合酶沿着模闆鏈從5’到3’的方向合成新(xīn)鏈，當DNA聚合酶到達Taqman探針結合位點時，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性會将Taqman探針進行水解，導緻Taqman探針的報告基團脫離了猝滅基團，從而發出熒光。可(kě)以根據熒光值的高低，判斷PCR過程中(zhōng)目的片段産(chǎn)生的多(duō)少，從而實現對目的基因進行實時定量。

在Taqman qPCR中(zhōng)，上下遊引物(wù)隻有(yǒu)擴增探針所結合的片段時，才會産(chǎn)生熒光，非特異擴增是不會産(chǎn)生熒光的，因此Taqman qPCR的特異性非常好。另外，可(kě)以用(yòng)不同的報告基團，标記多(duō)個熒光探針，實現在一管PCR體(tǐ)系中(zhōng)，同時對多(duō)個基因進行定量，這樣不僅實驗的通量大大提高，而且實驗的一緻性也更好。

什麽時候需要使用(yòng)探針法qPCR:

相對于SYBR Green qPCR，探針法qPCR需要設計和合成特異的熒光探針，增加了設計難度和實驗成本。但是，當你遇到如下情況時，Taqman qPCR是你的第一選擇。

>>>1.基因檢測

以Taqman為(wèi)代表的探針法qPCR最常用(yòng)的應用(yòng)場景就是基因檢測，包括醫(yī)療診斷，環境微生物(wù)檢測，轉基因檢測等。這些應用(yòng)場景對結果的特異性要求非常高，而染料法qPCR的結果很(hěn)容易受到非特異性擴增的幹擾，因此一般都是使用(yòng)Taqman qPCR進行檢測。

>>>>2.很(hěn)難設計特異性引物(wù)

qPCR對引物(wù)的擴增效率要求很(hěn)高，如果用(yòng)相對定量法（Livak法）進行數據分(fēn)析，需要保證引物(wù)的擴增效率在90%到105%之間，否則最後得到的數據不真實。然而有(yǒu)時候，為(wèi)了保證擴增的特異性，隻能(néng)在某個特異位點設計引物(wù)，從而犧牲了一些其它的引物(wù)設計原則，比如GC含量過高，引物(wù)有(yǒu)二級結構等，導緻qPCR擴增的效率過低。這種情況下用(yòng)Taqman qPCR可(kě)以很(hěn)好的解決這一點，因為(wèi)Taqman 探針本身就可(kě)以保證特異性，因此設計引物(wù)的時候有(yǒu)更多(duō)靈活性，更容易設計擴增效率高的引物(wù)對。

>>>>3.發表高水平文(wén)章

由于Taqman法比SYBR Green法具(jù)有(yǒu)更好的特異性，實驗結果更接近真實，所以很(hěn)多(duō)高水平文(wén)章更青睐于Taqman qPCR的結果。特别是一些關鍵基因的關鍵結果，如果有(yǒu)Taqman qPCR的數據，會給你的文(wén)章加分(fēn)不少。