ReadyPour™ 5% Bis Tris Solution是一種Acrylamide膠預混液，該預混液安(ān)全、快速、操作(zuò)簡單、解析度高
本品已預先配制成 5% 濃縮膠液體(tǐ)，按照百分(fēn)之一的比例加入相應量的 10%過硫酸铵或其替代物(wù)溶液
按照千分(fēn)之一的比例加入相應量的 TEMED。
例如 10ml 12% SDS-PAGE 分(fēn)離膠預混液中(zhōng)，加入 100μl 10%過硫酸铵和 10μl TEMED
即可(kě)直接灌膠，能(néng)在10分(fēn)鍾以内完成凝膠（夏季3-5分(fēn)鍾）
凝膠時間快，無須再自行配置並節省時間
注意：
1.APS和TEMED品質(zhì)的好壞會影響凝膠時間，請用(yòng)新(xīn)鮮配制的APS;
2.由于凝膠速度快,請勿比照傳統制膠方式采用(yòng)槍頭轉移進行灌膠;
3.灌入分(fēn)離膠後記得取起制膠架輕輕拍敲桌面以利膠體(tǐ)鍵結緊實;
4.分(fēn)離膠與濃縮膠之間無須用(yòng)水壓平,因此灌上層濃縮膠時不要在固定位點擠壓灌膠;
5.抽拔齒梳時, 齒梳左右二邊一定要平,輕緩慢慢拔起;
操作(zuò)方式:
1.擠壓瓶中(zhōng)加入相應比例TEMED和APS後即可(kě)進行灌膠
(等同傳統計算方式:TEMED為(wèi)配膠總體(tǐ)積的千分(fēn)之一,APS為(wèi)配膠總體(tǐ)積的百分(fēn)之一)
2.分(fēn)離膠灌膠完成後取濃縮膠擠壓瓶在玻璃闆中(zhōng)空縫隙中(zhōng)左右移動輕輕擠壓灌入制作(zuò)濃縮膠
3.插上齒梳等待凝膠
濃縮膠擠壓瓶中(zhōng)的剩餘預混液凝結成果凍狀後,即代表已凝膠
用(yòng)于制備SDS Page凝膠或WB實驗凝膠
學(xué)習Western Blot技(jì )術，首先要學(xué)習的就是手灌膠技(jì )術。
手灌膠技(jì )術是WB實驗中(zhōng)最基本的技(jì )術，雖然現在預制膠橫行天下
但是對于某些特定蛋白或比較極端分(fēn)子量的蛋白，
預制膠達不到好的分(fēn)離效果
有(yǒu)些表達量極低的蛋白預制膠膠孔達不到足夠上樣量
我們就需要根據待分(fēn)離蛋白的特性來配制聚丙烯酰胺凝膠
傳統制膠及步驟繁瑣之處:
（1）手灌膠各成分(fēn)介紹；
a.丙烯酰胺：形成聚丙烯酰胺的基本物(wù)質(zhì)，具(jù)有(yǒu)神經毒性及緻癌性（WB所用(yòng)試劑幾乎都具(jù)有(yǒu)強毒性，做好實驗的前提，先要保護好自己）；
b.Tris-Hcl:在蛋白電(diàn)泳中(zhōng)與Gly構成緩沖體(tǐ)系，穩定電(diàn)泳過程中(zhōng)的PH穩定，Tris（氨丁三醇）可(kě)緻癌；
c.過硫酸铵（AP）：相當于催化劑作(zuò)用(yòng)，提供兩種丙烯酰胺聚合所必須的自由基；
d.TEMED（四甲基二乙胺）:催化過硫酸铵産(chǎn)生自由基，從而引發聚合反應，促進聚丙烯酰胺凝膠形成（凝固劑）,具(jù)有(yǒu)強烈刺激性氣味（惡臭），并具(jù)強神經毒性；
e.SDS（十二烷基硫酸鈉）：能(néng)使蛋白變性，具(jù)有(yǒu)呼吸刺激性。
（2）常用(yòng)分(fēn)離膠濃度與最佳分(fēn)離範圍；
| 分(fēn)離膠濃度 |
最佳分(fēn)離範圍（kD） |
| 6% |
50—150/60-220 |
| 8% |
30—90 |
| 10% |
20—80 |
| 12% |
12—60 |
| 15% |
10–40 |
備注：分(fēn)離膠濃度越大，最佳分(fēn)離蛋白分(fēn)子量越小(xiǎo)。
（3）分(fēn)離膠配制(兩塊膠量—10ml)；
| 成分(fēn) |
分(fēn)離膠濃度 |
| 6% |
8% |
10% |
12% |
15% |
| 超純水 |
5.3ml |
4.6ml |
4ml |
3.3ml |
2.3ml |
| 30%丙烯酰胺 |
2ml |
2.7ml |
3.3ml |
4ml |
5ml |
| 1.5M Tris（PH8.8） |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
| 10%SDS |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
| 10%AP |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
100μl |
| TEMED |
4μl |
4μl |
4μl |
4μl |
4μl |
備注：我們所說的膠濃度，實際是指丙烯酰胺濃度。
（4）濃縮膠配制：
| 成分(fēn) |
4ml量 |
6ml量 |
| 超純水 |
2.7ml |
4.1ml |
| 30%丙烯酰胺 |
660μl |
1.0ml |
| 1.5M Tris（PH6.8） |
500μl |
750μl |
| 10%SDS |
40μl |
60μl |
| 10%AP |
40μl |
60μl |
| TEMED |
4μl |
6μl |
備注：濃縮膠一般使用(yòng)2—3ml即可(kě)，濃度一般使用(yòng)5%。
（5）聚丙烯酰胺凝膠配制：
a.檢漏，選取清洗幹淨的模具(jù)玻璃，固定于膠固定器上，加入超純水，檢查模具(jù)是否漏液；
b.配制分(fēn)離膠，按所需濃度配制分(fēn)離膠，配制過程中(zhōng)最後加入TEMED，混勻後灌入模具(jù)，防止産(chǎn)生氣泡，并注意高度，最後輕輕加入超純水封口，使液面平整，凝固速度受室溫影響，溫度越高，凝固越快，冬天可(kě)放入孵箱中(zhōng)加速凝固；
c.待水和膠之間出現一道折線(xiàn)時，說明膠已凝固，此時，将水倒出，并用(yòng)吸水紙吸幹殘餘水分(fēn)；
d.濃縮膠配制，按需量配制濃縮膠，同樣最後加入TEMED，灌入分(fēn)離膠上面，灌滿模具(jù)，排氣泡後插入所需梳子，待膠凝固。
膠一般提前一天配制，配制完成後，可(kě)泡到電(diàn)泳液中(zhōng)，存放于4℃冰箱保存，第二天使用(yòng)。
手灌膠技(jì )術是WB的基礎入門級技(jì )術，相對于昂貴的預制膠，手灌膠性價比更高，對某些蛋白分(fēn)離效果更好。
系統的掌握WB技(jì )術，依賴于預制膠遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，預制膠雖然節省了配膠的時間，但還是有(yǒu)特殊蛋白需要手灌膠進行分(fēn)離。
采用(yòng)快速凝膠 5% 上層濃縮膠預混液簡易之處:
擠壓瓶中(zhōng)加入相應比例TEMED和APS後(等同傳統計算方式),在分(fēn)離膠灌膠完成後即可(kě)取濃縮膠擠壓瓶在玻璃闆中(zhōng)空縫隙中(zhōng),
左右移動輕輕擠壓灌入制作(zuò)濃縮膠後,即可(kě)插上齒梳等待凝膠
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