Bicinchoninic acid (BCA )法是近來廣為(wèi)應用(yòng)的蛋白定量方法。其原理(lǐ)與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡合并将Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結合形成穩定的紫藍色複合物(wù)，在562 nm處有(yǒu)高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據此可(kě)測定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作(zuò)簡單，試劑及其形成的紫蘭色複合物(wù)穩定性俱佳，并且受幹擾物(wù)質(zhì)影響小(xiǎo)。與Bradford法相比，BCA法的顯著優點是不受去垢劑的影響。

特點:

• 靈敏度高：最低可(kě)檢測出25 μg/ml，0.5 μg蛋白
• 線(xiàn)性範圍廣：線(xiàn)性範圍在25 ~2500 μg/ml
• 快速簡便：45分(fēn)鍾内完成測定，比經典的Lowry法快4倍而且更加方便
• 兼容性強：不受樣品中(zhōng)去垢劑等化學(xué)物(wù)質(zhì)的影響
• 穩定性好：蛋白間檢測變異系數遠(yuǎn)小(xiǎo)于Bradford法

【注意事項】

1、如果檢測效果不佳，可(kě)以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min，顔色會随着時間的延長(cháng)不斷加深。

   顯色反應也會随溫度升高而加快；如果濃度較低，可(kě)以适當延長(cháng)孵育時間或在較高溫度下孵育。

2、測定标準曲線(xiàn)時發現随着标準品濃度的增加吸光度或顔色沒有(yǒu)明顯變化，可(kě)能(néng)的原因是樣品中(zhōng)

   含有(yǒu)嚴重幹擾 BCA 法測定蛋白濃度的物(wù)質(zhì)。

3、BCA 法檢測中(zhōng)樣本中(zhōng)不應含有(yǒu) EDTA，否則影響檢測結果。

4、因 BCA 法測定時顔色會随着時間的延長(cháng)不斷加深，建議每次測定時都做标準曲線(xiàn)，并且顯色

   反應的速度和溫度有(yǒu)關，所以除非精(jīng)确控制顯色反應的時間和溫度，否則每次都做标準曲線(xiàn)。

5、如果沒有(yǒu)酶标儀，也可(kě)以使用(yòng)普通分(fēn)光光度計測定，但應考慮根據比色皿的最小(xiǎo)檢測體(tǐ)積。

   應按比例适當加大 BCA 工(gōng)作(zuò)液的用(yòng)量使總體(tǐ)積不小(xiǎo)于最小(xiǎo)檢測體(tǐ)積，樣品和标準品的用(yòng)量亦

   相應按比例放大；使用(yòng)分(fēn)光光度計測定蛋白濃度時，可(kě)以測定的樣品數量可(kě)能(néng)會顯著減少。

6、為(wèi)了加快 BCA 法測定蛋白濃度的速度可(kě)以适當加熱，但是切勿過熱，否則易失效。

7、為(wèi)保證蛋白的精(jīng)确定量，樣品的提取和标準蛋白的配制最好選用(yòng)相同的緩沖液，同時也要保證

   兩者檢測條件的一緻性。如果緩沖液本身就有(yǒu)較高的背景值，建議使用(yòng)其他(tā)的方法測定。