适用(yòng)于中(zhōng)等靈敏度檢測各種印迹膜檢測，包括Southern雜交、Northern雜交、Western blot沉澱、免疫組化等。

三種顯色方法ECL、NBT/BCIP和DAB的對比:

1.ECL

增強化學(xué)發光，一般含有(yǒu)魯米諾和H2O2、發光增強劑等物(wù)質(zhì)。發光試劑中(zhōng)的魯米諾被HRP和H2O2氧化，産(chǎn)生熒光，這個過程被發光增強劑加強。其中(zhōng)，增強劑在體(tǐ)系中(zhōng)扮演着核心角色，決定着ECL化學(xué)發光的發展。

理(lǐ)想的發光增強劑是：（1）發光靈敏，目前一般的發光增強劑都可(kě)以将發光靈敏度提高1000倍至100000倍以上；（2）發光穩定，這是目前研究的重點之一，發光不穩定的增強劑，容易在一些情況下發生“淬滅”，不容易被檢測到；（3）本底或背景低，這也是發展的方向之一，欲得到準确可(kě)靠的結果，就必須确保試劑的特異性，在無HRP或很(hěn)少HRP的情況下，不發光或很(hěn)少發光。

2.NBT/BCIP:

是堿性磷酸酶最佳的底物(wù)組合之一。在堿性磷酸酶（AP）的催化下，BCIP會被水解而産(chǎn)生強反應性産(chǎn)物(wù)，該産(chǎn)物(wù)與NBT發生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色化學(xué)物(wù)。該試劑盒可(kě)用(yòng)于堿性磷酸酶系統的IHC和WB實驗的酶促顯色。在AP的催化下，在組織切片或印迹膜上結合了AP偶聯物(wù)的地方産(chǎn)生深藍色沉澱，可(kě)根據顔色反應來确定目的蛋白的位置及表達情況。

3.DAB:

二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物(wù)酶的顯色底物(wù)，在過氧化氫的存在下失去電(diàn)子而呈現出顔色變化和積累，形成棕褐色不溶性産(chǎn)物(wù)，并就地原位沉澱。顯色反應原理(lǐ)如下：

HRP＋H2O2+DAB→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓

該方法特異性好，性能(néng)穩定，操作(zuò)便捷，适用(yòng)于蛋白質(zhì)雜交和免疫化學(xué)，其終産(chǎn)物(wù)可(kě)直接在普通環境下觀察，但靈敏度是這三種方法中(zhōng)最低的，僅能(néng)達到500pg。

綜合如上所述，ECL和DAB都是HRP的底物(wù)，NBT/BCIP的酶是堿性磷酸酶。而且三者的顔色顯示不同，DAB的顯色是棕褐色，NBT/BCIP顯藍色，ECL顯熒光。在靈敏度方面，ECL化學(xué)發光的靈敏度最高，為(wèi)1~5pg，也有(yǒu)達到fg級的，BCIP/NBT的靈敏度100pg，DAB的靈敏度最低，大約為(wèi)500pg。在試驗中(zhōng)進行選擇時，可(kě)根據不同的酶以及靈敏度等進行選擇，并且注意操作(zuò)時應佩戴手套，避免将顯色劑與皮膚接觸，用(yòng)後及時徹底沖洗。